Описание
Основное
Система для непрерывного культивирования, концентрирования, отмывки
Первоначально система ATF™ от Refine Technology (Repligen Corporation) была разработана для процессов культивирования клеток млекопитающих в непрерывном режиме с перфузией, при этом для достижения эффективного разделения клеток вместе с низким сдвиговым напряжением и механическим стрессом для клеток фильтрующей основой был выбран фильтр с полыми волокнами (hollow fiber) - подобная система обеспечивает надежное и линейное масштабирование для крупномасштабного производства. Данная система быстро зарекомендовала себя как наиболее предпочтительная система перфузии на рынке и сегодня используется в нескольких крупнейших мировых биофармацевтических компаниях для крупномасштабного коммерческого непрерывного (перфузионного) производства рекомбинантных белков и моноклональных антител.
Стандартные, классические биореакторы (ферментеры) из стекла для лабораторных исследовательских задач, а также пилотные и промышленные стальные биореакторы / ферментеры просто интегрируются с системами перфузии ATF через стандартные адаптеры и порты. Мы имеем огромный успешный опыт интеграции систем ATF с биореакторами и ферментерами таких марок и мировых брендов как: Applikon Biotechnology*, New Brunswick / Eppendorf, Bioengineering, Infors, DasGip, Sartoirus Biolafitte/Pierre Guerin и другими.
*компания АБТЕК рекомендует и проводит интеграцию систем перфузии ATF со всеми моделями стеклянных, пилотных и одноразовых биореакторов от компании Applikon Biotechnology
Растущий спрос и интерес вместе со всеобщей тенденцией к работе с одноразовыми технологиями в биопроцессе потребовали от систем ATF Refine Technology (Repligen Corporation) иметь возможность простого и надежного одноразового соединения с биореакторами волного типа (на качающейся платформе), биореакторами с мешалкой и орбитальными биореакторами. Сегодня надежное соединение достигается при использовании таких одноразовых коннектеров как Kleenpack (от Pall), DAC (от GE), а также Opta (от Sartorius Stedim). На сегодняшний день системы перфузии ATF имеют широкий опыт применения и работы со всеми доступными на рынке и известными производителями одноразовых биореакторов с объемами от 1 литра до 1000л и более: орбитальные биореакторы Kuhner SB-X (OrbShake), Applikon AppliFlex, Hyclone SUB, GE Wave, GE XCellerex, Sartorius Cultibag и Sartorius STR, ATMI, NewBrunswick Celligen Blu и Millipore CellReady.
За последние 10-15 лет Refine (Repligen Corporation) предлагала различные типы фильтрационных модулей для систем перфузии ATF, но последнее время специальный сетчатый фильтр с порогом отсечения 70 мкм становится все более популярным: сетчатый фильтр с порогом отсечения 70мкм подходит для адгезивных клеток и для процессов, предназначенных для культивирования на микроносителях. Процессы с производством вакцин на основе клеток MDCK или Vero особенно ярко демонстрируют преимущества при использовании системы ATF. В последние 5 лет рост крупномасштабного культивирования стволовых клеток показывает задачи для новейших процессов. Стволовые клетки часто растут на микроносителях и тем самым процесс сильно выигрывает от простоты использования системы ATF, по сравнению с традиционными подходами к многократным циклам промывки и этапам сепарации клеток на микроносителях. Концентрирование стволовых клеток также может быть проведено просто и за короткие сроки при этом не нанося культуре клеток механического стресса.
Особенности системы ATF Refinetech:
- Нет перистальтических насосов – рециркуляционный насос реализован как диафрагменный насос с с низким сдвиговым напряжением.
- Система ATF дает ламинарный поток с низким сдвиговым напряжением
- Высокие скорости потоков (от 0,25 л/мин до 80 л/мин)
- Работа ATF создает эффект самоочистки фильтрационного модуля: вымывание отложений, снижения образования биопленки, очистка пор фильтр.
- Более эффективное использование фильтра – снижение затрат
- Идеальна подходит для поддержание высокого роста клеток и достижения сверхвысоких плотностей клеток
Удобство стерилизации:
- Одно соединение с сосудом – автоклавирование совместно с биореактром.
- Возможность повторной стерилизации соединений
- Отдельна стерилизация системы и подключение к одноразовым биореакторам
Ниже приведены модели и приблизительное руководство по масштабированию и использованию систем ATF с биореакторами различных размеров:
АБТЕК – эксклюзивный дистрибьютор Refine Technology (Repligen Corporation) в России и СНГ.
Технические характеристики
Система ATF™ основана на технологии переменного тангенциального потока (Alternating Tangential Flow), который создается при постоянной работе диафрагмы вверх и вниз относительно вертикальной оси в пределах головки насоса, соединённого с корпусом системы, подключенной к стандартному биореактору.
Интерес к системе обусловлен уникальными результатами, которые демонстрирует эта простая технология.
Схема системы перфузии клеток ATF Refine Technology (Repligen Corporation)
Это упрощенное видео демонстрирует, что происходит внутри системы перфузии ATF от Refine (Repligen Corporation) при подсоединение к биореактору. На видео изображен традиционный биореактор из нержавеющей стали с соединением, реализованным через два двустворчатых клапана, стерилизуемых паром. Однако одноразовые биореакторы просты на столько, что вам потребуется лишь соединить их с системой ATF через одноразовый коннектор типа Kleenpack (Pall) или ReadyMate (GE).
- Сжатый воздух подается ко дну головки насоса системы ATF
- Давление воздухом и силы потока аккуратно поднимает диафрагму вверх, создавая интенсивный поток клеток и среды также вверх через систему ATF
- Как видно создается быстрый поток через полые волокна, с обратным потоком фильтрата, показанным справа (для сбора продукта, очистки, концентрирования и т.д.)
- Поток среды и клеток продолжает движение через систему в биореактор
- Затем система реверсирует: воздух поглощается обратно через дно насоса
- Диафрагма движется вниз создавая интенсивный поток от реактора через систему ATF, уже готовую к новому циклу.
- Подобный цикл повторяется примерно каждые 5 секунд
Уникальная особенность системы перфузии ATF заключается в ее постоянной способности к снижению обрастания и забивания поверхности фильтра. Сочетание обратного потока через фильтр с переменными циклами высокого и низкого давления способствуют не только созданию более эффективного тангенциального потока, но также и в образование значительных трансмембранных потоков с действием обратной промывки на каждом рабочем цикле. Тогда как объемы на обратную промывку могут быть достаточно малы, их вполне хватает для того чтобы поры фильтра не забивались даже при крайне высоких концентрациях клеток, более чем 200 млн клеток/мл! Подобная работа системы ATF позволяет использовать фильтры с меньшей эффективной поверхностью фильтрования, чем если бы использовалась другая технология с применением фильтров.
На данном видео демонстрируется контроллер и головка насоса системы перфузии ATF4. Головка насоса специально открыта (корпус с фильтрационным модулем сняты) для просмотра действия диафрагмы в срезе и наглядно. Подобная система как правило интегрируется с биореактором рабочим объемом 10л.
В первую очередь контроллер управляет потоком сжатого воздуха и направляет его к низу головки насоса системы ATF и тем самым приводит диафрагму в действию и прогибанию вверх. Когда диафрагма достигает верха детектируется ее максимальное расширение и контроллер переключается на работу источника вакуума, чтобы вернуть диафрагму в обратное положение и вогнуть во внутрь ко дну головки насоса. Описанный цикл повторяется каждые 5-10 секунд в каждом направлении, что в итоге дает общее время работы цикла примерно 10-20 секунд.
Большая площадь поверхности диафрагмы минимизирует сдвиговое напряжение при движении диафрагмы. Головка насоса системы ATF4 вытесняет примерно 400 мл жидкости с каждого оборота, таким образом данное мягкое и медленное движение производит поток с достаточно быстрой скоростью около 3-4 литров в минуту.
Возможность ATF системы создавать быстрые скорости потока жидкости и при этом иметь низкие сдвиговые силы имеет много преимуществ для культуры клеток, в том числе и для бережной сепарации агрегатов, очистки поверхности фильтра и поддержания чрезвычайно высоких концентраций клеток (100-200 млн клеток на миллилитр) в различных клеточных линиях, включая СНО и PER.C6 ®.
Применение
Перфузия и концентрированная перфузия
Системы с использованием технологий рециркулирующего потока и полых волокон применялись достаточно давно, но с переменным успехом. Частой проблемой с подобной и со всеми другими системами перфузии является сложность масштабирования и в то же время сохранение стерильности процесса.
Масштабирование во многих системах перфузии и сепарации клеток основаны на площади поверхности, или на типе разделительной камеры таким образом, что после передачи в промышленные условия становится весьма сложно вести процесс эффективно и надежно. Многие компании, которые используют спин-фильтры или, например, центрифуги, инвестируют значительное количество времени для оптимизации своих под час уникальных установок.
Типичные проблемы других систем перфузии заключаются в повреждении клеток, времени, которое клетки находятся вне биореактора (т.е. вне гомогенных оптимальных условий роста). Эти проблемы исключены в системе перфузии ATF™ при использовании в промышленных масштабах. Масштабирование систем ATF практически линейное. Системы перфузии и сепарации клеток ATF просты в настройки, работе, валидации и обслуживании. С системой ATF от Refine (Repligen Corporation) разработка процесса становится на столько простой, что требует только немного оптимизации оборудования и все основное время пользователь может тратить на улучшение состава питательной среды и условий культивирования в биореакторе. Система перфузии ATF позволяет быстро достигнуть внушительных концентраций клеток!
Ключевые преимущества:
- Низкий стресс и сдвиговое напряжение
- Клетки находятся в постоянно гомогенных с биореактором условиях
- Стремительное увеличение концентрации биомассы
Некоторые клеточные линии демонстрируют уменьшение размера клетки, что позволяет проходить более быстрому молекулярного переносу через клеточную стенку (увеличение площади поверхности к объему). Вместе эти преимущества обеспечивают высокую жизнеспособность и более высокие скорости роста клеток и тем самым приводят к невероятно высоким концентрациям клеток почти в каждой тестируемой клеточной линии.
Перфузия
Перфузия стала рассматриваться в качестве варианта процесса культивирования, когда стабильность белка низкая или уровень экспрессии клеточной линии минимален на столько, что постоянный выход продукта становиться более экономически выгодным. Процесс перфузии страдал от сложного и ненадежного оборудования, что приводило к отталкиванию привлекательности технологии у технологов и создавал миф о сложности разработки и управлением процессом.
Сегодня все эти проблемы решает система перфузии ATF. Во многих случаях система ATF от Refine (Repligen Corporation) делает процесс легче, чем процесс культивирования с подпитками (fed-batch)!
Концентрированная перфузия
Несколько мировых блокбастеров и топовых фармацевтических препаратов производятся на основе непрерывного процесса культивирования клеток с использованием перфузия (ATF системы), и у многих компаний в планах стоит развитие этого направления. Во многом рост процессов с перфузией обусловлен использованием технологии ATF Refine Technology (Repligen Corporation). Итак, что же такое концентрированная перфузия и как она может улучшить существующие методы перфузии?
Ключевые преимущества:
- Сверхвысокие концентрации клеток, в диапазоне 70-200 млн клеток/мл
- Жизнеспособность клеток от 90% и выше
- Требует 1-3 объема оборота среды в день (не больше)
- Такое же простое управление за процессом, как и с перфузией – но с более высокой продуктивностью
- Может быть использована направлено для наработки биомассы (без белка или вируса) – например для использования в качестве банка клеток с cиcтемой ATF
Концентрирование клеток / быстрый оборот среды
Жизнеспособность клеток критический параметр в особенности для тех областей применения, когда качество или экспрессия продукта может находиться под влиянием медленного или повреждающего процессинга. Система ATF™ от Refine (Repligen Corporation) обеспечивает значительное преимущество перед другим оборудованием, таким как TFF (тангенциальная фильтрация), глубинная фильтрация, или центрифугирование благодаря возможности работать при низких сдвиговых напряжениях и быстрой самоочистки поверхности фильтра.
Раньше оператор был бы доволен потратив 3-4 часа на концентрирование 20-200 млн клеток с объема 50 литров. Сегодня система перфузии ATF упрощает отработку промышленных процессов благодаря упрощению процесса, что позволяет проводить процесс в 3-4 раза быстрее, в основном снижая ручные операции с клеточным материалом и, таким образом, с каждым разом снижая риск до минимума. Обычно, и капитальные затраты и общие затраты значительно снижаются. Например, одноразовый биореактор объемом 200л может быть сконцентрирован до 20л за один час получая концентрацию клеток в 20-50 млн/мл, при этом жизнеспособность этих клеток не падает!
Банк клеток и наработка посевного материала (seed expansion)
Создания банка клеток как правило достаточно трудозатратный ручной процесс с использованием центрифуг и серий концентрирований, сепараций и операций ресуспендирования и, увы, зачастую является весьма вариабельным процессом. Произведенный клеточный банк обычно представлен виалами содержащими 1мл или 10мл клеточной суспензии одинаковой концентрации (и жизнеспособности). Так как на создания банка клеток уходит несколько часов (или до целого дня, в зависимости от количества виал), то это просто невозможно ожидать, что первая и последняя виалы с клетками будут одинаковыми.
Клетки в этих виалах – один из важнейших элементов производственного процесса, так как они являются его началом. Классически для производства размораживают несколько виал из банка клеток и проводят серии параллельных культивирований для наработки первичного посевного материала. Лучшую по паказателям партию отбирают для дальнейшего инокуулирования первого биореактора в процесса в производстве. Подобный подход невозможно избежать т.к клеточный бакн был создан путем неэффективных ручных манипуляций.
В подобных шагах существует риск, неопределенность и вариабельность на ряду со значительными затратами времени.
Создание клеточных банков с системой ATF может решить все эти проблемы с описанными процедурами. Мы предлагаем подход, который будет гарантировать, что клетки постоянно находятся в благоприятной гомогенной окружающей среде в стерильном биореакторе, к примеру, они совершенно не испытывают стресс из-за отсутствия кислород, из-за центрифугирования или голодания от отсутствия критических питательных компонентов. Среда заменяется, и замораживающая жидкость мгновенно замораживает содержимое реактора и клеточный банк перенесен в одноразовые мешки без каких-либо ручных операций концентрирования или открытия системы. Весь такой процесс можно автоматизировать и реализовать в течении одного часа: первый одноразовый мешок с банком клеток будет идентичен каждому последующему – и это можно валидировать!
Наработка посевного материала (seed expansion) с системой ATF Refinetech позволит вам избавиться от вариаций с первого пассажа от банка клеток к биореактору. Вы можете проводить инокуляцию первого небольшого биореактора напрямую клеточным банком из морозилки без необходимости центрифугирования и избавления от ДМСО. Полное отсутствие операций с открытой системой! В зависимости от вашей производственной площадки биореактор может быть от 5л до 50л или крупнее, наработка клеток проходит в режиме концентрированной перфузии до получения сверхвысоких концентраций клеток, например, 70-150 млн/мл. Этот первый посевной биореактор может служить инокуляционным реактором для более крупного биореактора в каскаде (20-50х), и при этом без внесения перебоя в стандартные шаги масштабирования. Подобный процесс будет экономить значительно больше времени, финансов, а также снизит производственный риск для каждой партии.
Ниже приведены типовые процессы, где производственная платформа ATF дает видимое и/или значительное преимущество:
- организация клеточного банка (cell banking)
- наработка посевного материала (seed expansion)
- концентрирование клеток (cell concentration)
- культивирование клеток – перфузия, CFB, гибридные процессы
- обмен среды (medium exchange)
- предварительная очистка белков / моноклональных антител и др. продуктов
- фильтрация
- диафильтрация
- концентрирование вирусов / белков
- удаление вирусов (virus removal)
